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抗體制備申請單

蛋白表達抗體制備技術服務

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抗體親和力測定

服務簡介

抗體親和力是指抗體與抗原表位或其決定簇之間的結(jié)合力，這種作用力包括氫鍵、引力、疏水作用力等。親和力大小可以用K_D表示，計算方法為：

K_D=[Ab-H]/([Ab][H])

式中[]代表摩爾濃度，Ab為抗體，H為半抗原，Ab-H為結(jié)合物。

服務內(nèi)容

百歐泰生物技術團隊運用平臺的技術系統(tǒng)對抗體的親和力和動力學進行測量，基于光學效應的技術－表面等離子體共振(Surface Plasmon Resonance, SPR)和生物膜層表面干涉技術（bio－layer　interferometry, BLI），可以檢測分子間相互作用并進行實時監(jiān)測。

測定方法

1. 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法）

ELISA法靈敏度高，檢測的數(shù)量級可以達到10-8，也是抗體親和力測定常用的方法。ELISA測定方法：抗體與定量的抗原在溶液中溫育進行反應，反應平衡后，將溶液轉(zhuǎn)移到含有固相抗原的聚苯乙烯微板內(nèi)，用間接ELISA法測定游離抗體量。根據(jù)OD值計算親和力常數(shù)K_D。當抗原量大于10倍抗體量時，可以忽略抗體含量。計算方法如下所示，其中A0為抗體的OD值，A1為加入質(zhì)量摩爾濃度為a的抗原后的OD值，K_d為K_D的倒數(shù)。

1+K_d/a=A₀/(A₀-A₁)

2. 生物膜干涉技術（BLI）

實驗原理：利用Fortebio Octet儀器測定抗體親和力。生物傳感器底端覆蓋有相互作用的分子生物膜，當傳感器上的分子生物膜與溶液中的分子發(fā)生作用時，生物層的厚度就會增加。將具有一定帶寬的可見光垂直射向生物膜，光在生物膜兩層界面中反射被光譜儀檢測到干涉波，生物膜厚度改變，導致干涉光譜曲線發(fā)生移動，通過相位移動定量分析生物膜表面分子數(shù)量和濃度變化。

抗體親和力測定.png

3. 固相放射免疫法（SP-RIA）

SP-RIA法在測定抗體親和力常數(shù)方面較為準確。測定方法：用抗原包被微板，加入定量單克隆抗體，溫育，達到平衡后，洗去未結(jié)合的單克隆抗體，加放射性同位素標記的抗小鼠lg二抗，溫育后洗滌，割下小孔后計數(shù)結(jié)合的放射性強度。這個方法前提是保持包被的抗原量不變。具體計算方法如下，式中[Ab]a為結(jié)合抗體濃度，[Ab]r為總抗體濃度，n為抗體結(jié)合價。

([Ab]_a /[Ab]_r-[Ab]_b)/[Ab]_a=-nK

4. 平衡透析法

平衡透析法測定抗體親和力要求配體必須是可以穿過半透膜的小分子且必須進行標記（如果抗原為大分子，則要求抗體片段能夠穿過半透膜）。標記后的配體緩沖液置于半透膜一側(cè)，特異性抗體置于另一側(cè)，隨著時間推移配體會穿過半透膜進入另一側(cè)，與特異性抗體結(jié)合，兩邊的配體濃度會漸漸達到平衡。反應平衡時，計算出親和力常數(shù)。公式中[Ab]為抗體結(jié)合位點的濃度，由抗體質(zhì)量摩爾濃度×抗體結(jié)合價計算而來；[H]為游離配體的質(zhì)量摩爾濃度，[b]為結(jié)合配體的質(zhì)量摩爾濃度。

1/[b]=1/(k[H][Ab])+1/[Ab]

5. 結(jié)合抗原沉淀法

這種方法的實驗原理是將單價抗原與抗體溫育進行反應，平衡后，用50%飽和硫氨酸或15%聚乙二醇進行沉淀，從而將游離抗原與結(jié)合體分離，分別測定濃度并計算出K_D。

6. 放射免疫法（RIA）

放射免疫法是將足夠過量的單克隆抗體與痕量的放射性標記抗原進行溫育，反應平衡后測定結(jié)合曲線，50%峰值結(jié)合處單克隆抗體結(jié)合價濃度的倒數(shù)就是K_D。

實驗服務流程

雙方溝通一致后確定實驗方案，確定服務要求-簽訂合同—預付款-開始實驗-成果交付