簡介
真核轉(zhuǎn)錄組測序（Eukaryotic Transcriptome Sequencing，RNA-Seq）是利用高通量測序技術(shù)對真核生物細胞內(nèi)的所有轉(zhuǎn)錄本（mRNA、lncRNA、circRNA等）進行測序和分析的方法。通過RNA-Seq，可以研究基因表達水平、可變剪接、新轉(zhuǎn)錄本發(fā)現(xiàn)、融合基因檢測以及非編碼RNA分析等，廣泛應(yīng)用于生物學研究、醫(yī)學診斷和藥物開發(fā)等領(lǐng)域。
有參轉(zhuǎn)錄組和無參轉(zhuǎn)錄組
有參轉(zhuǎn)錄組測序（Reference-Based RNA-Seq）是指利用已知的參考基因組進行比對和定量分析，適用于已有高質(zhì)量基因組的物種。
無參轉(zhuǎn)錄組測序（De Novo RNA-Seq）是指在沒有參考基因組的情況下，直接對轉(zhuǎn)錄本進行測序、組裝和注釋。適用于缺乏高質(zhì)量參考基因組的物種。
表1 有參轉(zhuǎn)錄組和無參轉(zhuǎn)錄組的區(qū)別
比較項 | 有參轉(zhuǎn)錄組（Reference-Based） | 無參轉(zhuǎn)錄組（De Novo） |
依賴參考基因組 | 需要 | 不需要 |
適用物種 | 模式生物、已知基因組物種 如人類、小鼠、擬南芥等 | 非模式生物、新物種 如某些植物、昆蟲、海洋生物等 |
組裝難度 | 較低（直接比對） | 較高（依賴測序深度和組裝算法） |
分析準確性 | 較高（基于參考基因組） | 依賴組裝質(zhì)量 |
常見分析流程 | 1. 數(shù)據(jù)質(zhì)控（FastQC、Trimmomatic） 2. 比對到參考基因組（Hisat2、STAR、TopHat2） 3. 基因表達定量（HTSeq、featureCounts） 4.差異表達分析（DESeq2、edgeR） 5.功能富集分析（GO、KEGG） | 1. 數(shù)據(jù)質(zhì)控（去除低質(zhì)量reads和接頭序列） 2. 轉(zhuǎn)錄本組裝（使用Trinity、SOAPdenovo-Trans等工具） 3. 基因功能注釋（比對到Nr、Swiss-Prot、KEGG等數(shù)據(jù)庫） 4. 差異表達分析（基于組裝轉(zhuǎn)錄本進行定量） |
主要應(yīng)用 | 基因表達分析、可變剪接研究 | 新基因發(fā)現(xiàn)、物種進化研究 |
轉(zhuǎn)錄組測序的流程
1. 樣品采集（血樣，胚胎，動植物組織等）：在無RNase環(huán)境下完成采集（DEPC水處理耗材，操作臺UV滅菌），根據(jù)組織特性需要液氮速凍研磨等操作。
2. 總RNA提取：以動物細胞為例，總RNA提取需在無RNase環(huán)境下，用TRIzol裂解細胞后經(jīng)氯仿分層獲取水相，異丙醇沉淀RNA并用乙醇洗滌，最后用DEPC水溶解。其質(zhì)量檢測須達到以下標準：
Nanodrop：OD260/280≈2.0（純凈RNA），OD260/230>1.8（無鹽污染）
Agilent 2100：RIN≥8（真核樣本合格標準）
電泳：28S/18S條帶亮度比≈2:1（完整RNA）
3. cDNA建庫：用oligo dT磁珠富集帶有Poly A尾端的mRNA，將mRNA片段化，反轉(zhuǎn)得到cDNA，鏈接adapter之后進行擴增。
4. 上機測序：有參轉(zhuǎn)錄組常用illumina NovaSeq 6000，無參則可在此基礎(chǔ)上與全長測序聯(lián)合使用以提高組裝的準確性，常用PacBio Sequel II/IIe和Oxford Nanopore PromethION。
5. 質(zhì)控分析達標后，有參轉(zhuǎn)錄組可與基因組進行比對，無參轉(zhuǎn)錄組則需組裝注釋。
6. 表達定量分析，更具需求進行差異基因分析、聚類分析和富集分析等。
參考文獻
[1]崔凱,吳偉偉,刁其玉.轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的研究和應(yīng)用進展[J].生物技術(shù)通報,2019,35(07):1-9.
[2]Wang Z, Gerstein M, Snyder M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics[J]. Nature reviews genetics, 2009, 10(1): 57-63.
[2]Haas B J, Papanicolaou A, Yassour M, et al. De novo transcript sequence reconstruction from RNA-seq using the Trinity platform for reference generation and analysis[J]. Nature protocols, 2013, 8(8): 1494-1512.
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