蛋白表達(dá)系統(tǒng)概述
蛋白表達(dá)系統(tǒng)是指由宿主、外源基因、載體和輔助成分組成的體系。通過這個(gè)體系可以實(shí)現(xiàn)外源基因在宿主中表達(dá)的目的。一般由以下幾個(gè)部分組成：
1、宿主。表達(dá)蛋白的生物體�？梢詾榧�(xì)菌、酵母、植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞等。由于各種生物的特性不同，適合表達(dá)蛋白的種類也不相同。
2、載體。載體的種類與宿主相匹配。根據(jù)宿主不同，分為原核（細(xì)菌）表達(dá)載體、酵母表達(dá)載體、植物表達(dá)載體、哺乳動(dòng)物表達(dá)載體、昆蟲表達(dá)載體等。載體中含有外源基因片段。通過載體介導(dǎo)，外源基因可以在宿主中表達(dá)。
3、輔助成分。有的表達(dá)系統(tǒng)中還包括了協(xié)助載體進(jìn)入宿主的輔助成分。比如昆蟲-桿狀病毒表達(dá)體系中的桿狀病毒。
蛋白表達(dá)科學(xué)研究
rBPI56或其功能性氨基端片段通常在真核細(xì)胞中表達(dá)，將有助于獲得具有生物學(xué)活性抗G菌重組蛋白。但因該種表達(dá)方式存在成本高、表達(dá)量低等問題而影響其實(shí)際應(yīng)用。用原核細(xì)胞表達(dá)BPI23-Fcγ1重組蛋白。
Profinity eXact融合標(biāo)簽表達(dá)系統(tǒng)：利用bio-rad rofinity eXact 系統(tǒng)制備無(wú)標(biāo)簽、N 端無(wú)任何其它殘基 的重組蛋白只需大約1 小時(shí)。該親和介質(zhì)較為穩(wěn)定，可多次用于目的蛋白的純化，從而節(jié)約了 成本。適用于純化以不溶的聚集體形式存在的重組蛋白。Profinity eXact 融合標(biāo)簽系統(tǒng)的有效性和一致性將使其成為獲得高產(chǎn)率無(wú)標(biāo)簽重組蛋白的通用平臺(tái)。
蛋白表達(dá)系統(tǒng)分類及優(yōu)劣分析
原核蛋白表達(dá)系統(tǒng)既是最常用的表達(dá)系統(tǒng)，也是最經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的蛋白表達(dá)系統(tǒng)。原核蛋白表達(dá)系統(tǒng)以大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)為代表，具有遺傳背景清楚、成本低、表達(dá)量高和表達(dá)產(chǎn)物分離純化相對(duì)簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)主要是蛋白質(zhì)翻譯后缺乏加工機(jī)制，如二硫鍵的形成、蛋白糖基化和正確折疊，得到具有生物活性的蛋白的幾率較小。
酵母蛋白表達(dá)系統(tǒng)以甲醇畢赤酵母為代表，具有表達(dá)量高，可誘導(dǎo)，糖基化機(jī)制接近高等真核生物，分泌蛋白易純化，易實(shí)現(xiàn)高密發(fā)酵等優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)為部分蛋白產(chǎn)物易降解，表達(dá)量不可控。
哺乳動(dòng)物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)主要優(yōu)點(diǎn)是蛋白翻譯后加工機(jī)制最接近體內(nèi)的天然形式，最容易保留生物活性，缺點(diǎn)是表達(dá)量通常較低，穩(wěn)定細(xì)胞系建立技術(shù)難度大，生產(chǎn)成本高。
大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)
在各種表達(dá)系統(tǒng)中，最早被采用進(jìn)行研究的是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，也是目前掌握最為成熟的表達(dá)系統(tǒng)，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)以其細(xì)胞繁殖快速產(chǎn)量高、IPTG誘導(dǎo)表達(dá)相對(duì)簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)成為生產(chǎn)重組蛋白的最常用的系統(tǒng)。
對(duì)于表達(dá)不同的蛋白，需要采用不同的載體。目前已知的大腸桿菌的表達(dá)載體可分為非融合型表達(dá)載體和融合型表達(dá)載體兩種。非融合表達(dá)是將外源基因插到表達(dá)載體強(qiáng)啟動(dòng)子和有效核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列下游，以外源基因mRNA的AUG為起始翻譯，表達(dá)產(chǎn)物在序列上與天然的目的蛋白一致。融合表達(dá)是將目的蛋白或多肽與另一個(gè)蛋白質(zhì)或多肽片段的DNA序列融合并在菌體內(nèi)表達(dá)。融合型表達(dá)的載體包括分泌表達(dá)載體、帶純化標(biāo)簽的表達(dá)載體、表面呈現(xiàn)表達(dá)載體、帶伴侶的表達(dá)載體。
大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)在于遺傳背景清楚、繁殖快、成本低、表達(dá)量高、表達(dá)產(chǎn)物容易純化、穩(wěn)定性好、抗污染能力強(qiáng)以及適用范圍廣等。
酵母表達(dá)系統(tǒng)
酵母表達(dá)系統(tǒng)作為一種后起的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，由于兼具原核以及真核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，正在基因工程領(lǐng)域中得到日益廣泛的應(yīng)用，應(yīng)用此系統(tǒng)可高水平表達(dá)蛋白，且具有翻譯后修飾功能，故被認(rèn)可為一種表達(dá)大規(guī)模蛋白的強(qiáng)有力的工具。
常用的酵母表達(dá)系統(tǒng)：
一，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)表達(dá)系統(tǒng)：
釀酒酵母(Saecharomycescerevisiae)在釀酒業(yè)和面包業(yè)的使用已有數(shù)千年的歷史，被認(rèn)為是GRAS(generally recognized as safe)生物，不產(chǎn)生毒素，已被美國(guó)FDA確認(rèn)為安全性生物，但釀酒酵母難于高密度培養(yǎng)，分泌效率低，幾乎不分泌分子量大于30 kD的外源蛋白質(zhì)，也不能使所表達(dá)的外源蛋白質(zhì)正確糖基化，而且表達(dá)蛋白質(zhì)的C端往往被截短。因此，一般不用釀酒酵母做重組蛋白質(zhì)表達(dá)的宿主菌
二，甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母表達(dá)系統(tǒng)：
甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的酵母表達(dá)系統(tǒng)。目前甲醇酵母主要有漢森酵母屬(Hansenula)，畢赤酵母屬(Pichia)，球擬酵母屬(Torulopsis)等，并以畢赤酵母屬(Pichia)應(yīng)用最多。
甲醇酵母的表達(dá)載體為整合型質(zhì)粒，載體中含有與酵母染色體中同源的序列，因而比較容易整合入酵母染色體中，大部分甲醇酵母的表達(dá)載體中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因—1(AOX1)，在該基因的啟動(dòng)子(PAOX1)作用下，外源基因得以表達(dá)。甲醇酵母一般先在含甘油的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。培養(yǎng)至高濃度。再以甲醇為碳源。誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白。這樣可以大大提高表達(dá)產(chǎn)量。利用甲醇酵母表達(dá)外源性蛋白質(zhì)其產(chǎn)量往往可達(dá)克級(jí)。與釀酒酵母相比其翻譯后的加工更接近哺乳動(dòng)物細(xì)胞，不會(huì)發(fā)生超糖基化。
酵母表達(dá)的特點(diǎn)酵母是一種單細(xì)胞低等真核生物，培養(yǎng)條件普通，生長(zhǎng)繁殖速度迅速，能夠耐受較高的流體靜壓，用于表達(dá)基因工程產(chǎn)品時(shí)，可以大規(guī)模生產(chǎn)，有效降低了生產(chǎn)成本。
昆蟲表達(dá)系統(tǒng)
昆蟲表達(dá)系統(tǒng)是一類應(yīng)用廣泛的真核表達(dá)系統(tǒng)，它具有同大多數(shù)高等真核生物相似的翻譯后修飾加工以及轉(zhuǎn)移外源蛋白的能力。昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是目前國(guó)內(nèi)外十分推崇的真核表達(dá)系統(tǒng)。利用桿狀病毒結(jié)構(gòu)基因中多角體蛋白的強(qiáng)啟動(dòng)子構(gòu)建的表達(dá)載體，可使很多真核目的基因得到有效甚至高水平的表達(dá)。它具有真核表達(dá)系統(tǒng)的翻譯后加工功能，如二硫鍵的形成、糖基化及磷酸化等，使重組蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上更接近天然蛋白；其最高表達(dá)量可達(dá)昆蟲細(xì)胞蛋白總量的50%；可表達(dá)非常大的外源性基因(一200kD)；具有在同一個(gè)感染昆蟲細(xì)胞內(nèi)同時(shí)表達(dá)多個(gè)外源基因的能力；對(duì)脊椎動(dòng)物是安全的。由于病毒多角體蛋白在病毒總蛋白中的含量非常高，至今已有很多外源基因在此蛋白的強(qiáng)大啟動(dòng)子作用下獲得高效表達(dá)。常用的桿狀病毒包括苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)和家蠶型多角體病毒(BmNPV)，常用的宿主細(xì)胞則來(lái)源于草地夜蛾Sf9細(xì)胞，用于表達(dá)外源基因的質(zhì)粒來(lái)源于PUC系列，其含有一個(gè)多克隆位點(diǎn)和多角體蛋白啟動(dòng)子。 [2]
桿狀病毒系統(tǒng)的主要優(yōu)點(diǎn)包括：
1，組蛋白具有完整的生物學(xué)功能，如蛋白的正確折疊、二硫鍵的搭配
2，蛋白翻譯后的加工修飾；
3，表達(dá)水平高，可達(dá)總蛋白量的50%；
4，可容納大分子的插入片段；
5，能同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因。主要缺點(diǎn)是外源蛋白表達(dá)處于極晚期病毒啟動(dòng)子的調(diào)控之下，這時(shí)由于病毒感染，細(xì)胞開始死亡。
哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)
哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)外源重組蛋白可利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和病毒載體的感染。利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞需幾周甚至幾個(gè)月時(shí)間，而利用病毒表達(dá)系統(tǒng)則可快速感染細(xì)胞，在幾天內(nèi)使外源基因整合到病毒載體中，尤其適用于從大量表達(dá)產(chǎn)物中檢測(cè)出目的蛋白。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體必須包含原核序列、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、選擇標(biāo)記基因、終止子和多聚核苷酸信號(hào)等控制元件。